Гематологические анализаторы крови являются рабочими лошадками клинических лабораторий. Эти высокопроизводительные инструменты обеспечивают надежный подсчет эритроцитов, тромбоцитов и 5-компонентных лейкоцитарных формул, идентифицирующих лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Количество ядерных эритроцитов и незрелых гранулоцитов представляют собой 6-й и 7-й показатели. Хотя электрический импеданс по-прежнему является основным для определения общего количества и размера клеток, методы проточной цитометрии доказали свою ценность в дифференциации лейкоцитов и при исследовании крови на гематологическом анализаторе патологических клеток.
Эволюция анализатора
Первые автоматические приборы для количественного исследования крови, появившиеся в 1950 годах, действовали на основе принципа электрического импеданса Коултера, в котором клетки, проходя через небольшое отверстие, разрывали электрическую цепь. Это были доисторические анализаторы, которые только лишь производили подсчет и вычисляли средний объем эритроцитов, средний гемоглобин и его среднюю плотность. Тот, кто когда-либо считал клетки, знает, что это очень однообразный процесс, и два лаборанта никогда не дадут одинаковый результат. Таким образом, устройство позволило устранить эту вариативность.
В 1970 годах на рынок вышли автоматизированные анализаторы, способные определить 7 показателей крови и 3 компонента лейкоцитарной формулы (лимфоциты, моноциты и гранулоциты). Впервые был автоматизирован ручной подсчет лейкограммы. В 1980 годах один инструмент уже мог рассчитывать 10 параметров. 1990-е годы привели к дальнейшим улучшениям в дифференциалах лейкоцитов с использованием проточных методов, основанных на свойствах электрического импеданса или рассеяния света.
Производители гематологических анализаторов часто стремятся отделить свои приборы от продукции конкурентов, сосредоточившись на конкретном пакете используемых технологий дифференциации белых кровяных клеток или подсчета тромбоцитов. Однако специалисты по лабораторной диагностике утверждают, что большинство моделей отличить трудно, поскольку все они используют похожие методы. Просто добавляют дополнительные возможности, чтобы они выглядели иначе. Например, один автоматический гематологический анализатор может определять дифференциалы лейкоцитов путем помещения флуоресцентного красителя в ядро клетки и измерения яркости свечения. Другой может изменять проницаемость и регистрировать скорость поглощения красителя. Третий способен измерять активность фермента в клетке, помещенной в конкретный субстрат. Также существует метод объемной проводимости и рассеяния, который анализирует кровь в ее близком к естественному состоянии.
Новые технологии развиваются в сторону проточных методов, когда клетки поочередно подвергаются исследованию оптической системой, которая может измерять множество параметров, никогда ранее не измерявшихся. Проблема в том, что каждый производитель желает создать свой собственный метод, чтобы сохранить свою идентичность. Поэтому часто они преуспевают в одной области и отстают в другой.
Современное состояние
По мнению специалистов, все гематологические анализаторы на рынке, как правило, надежны. Различия между ними незначительны и касаются дополнительных возможностей, которые могут кому-то понравиться, а кому-то нет. Однако решение о покупке инструмента обычно зависит от его цены. Если раньше стоимость не являлась проблемой, то сегодня гематология становится очень конкурентным рынком, и иногда ценообразование (а не лучшая доступная технология) влияет на приобретение анализатора.
Новейшие высокопроизводительные модели могут работать как в виде отдельного инструмента, так и в составе автоматической системы с несколькими приборами. Полностью автоматизированная лаборатория включает гематологические, химические и иммунохимические анализаторы с автоматизированными входами, выходами и холодильными установками.
Лабораторные инструменты зависят от исследуемой крови. Для ее различных видов требуются специальные модули. Гематологический анализатор в ветеринарии настроен на работу с форменными элементами различных видов животных. Например, ProCyte Dx компании Idexx может исследовать пробы крови собак, кошек, лошадей, быков, хорьков, кроликов, песчанок, свиней, морских свинок и карликовых свиней.
Применение поточных принципов
Анализаторы сопоставимы в определенных областях, а именно в определении уровня лейкоцитов и эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов. Это обычные, типовые показатели, в значительной степени одинаковы. Но являются ли совершенно идентичными гематологические анализаторы? Конечно, нет. Некоторые модели основаны на принципах импеданса, некоторые используют лазерное рассеяние света, а другие используют флуоресцентную проточную цитометрию. В последнем случае применяются флуоресцентные красители, которые окрашивают уникальные характеристики клеток, чтобы их можно было разделить. Таким образом, появляется возможность добавить дополнительные параметры к лейкоцитарным и эритроцитарным формулам, в т. ч. подсчитать количество ядерных эритроцитов и незрелых гранулоцитов. Новым показателем является уровень гемоглобина в ретикулоцитах, который используется для мониторинга эритропоэза и незрелой фракции тромбоцитов.
Прогресс в технологии начинает замедляться по мере того, как возникают целые гематологические платформы. Тем не менее все еще имеют место многочисленные усовершенствования. Почти стандартным сейчас является общий анализ крови с подсчетом ядросодержащих эритроцитов. Кроме того, возросла точность подсчета тромбоцитов.
Другой стандартной функцией анализаторов высокого уровня является определение числа клеток в биологических жидкостях. Подсчет количества лейкоцитов и эритроцитов это трудоемкая процедура. Обычно она производится вручную на гемоцитометре, занимает много времени и требует наличия квалифицированного персонала.
Следующим важным шагом в гематологии является определение лейкоцитарной формулы. Если раньше анализаторы могли только помечать бластные клетки, незрелые гранулоциты и атипичные лимфоциты, то теперь появилась необходимость в их подсчете. Многие аналитики упоминают о них в форме исследовательского показателя. Но большинство крупных компаний работают над этим.
Современные анализаторы обеспечивают хорошую количественную, но не качественную информацию. Они хороши для подсчета частиц и могут отнести их к определенной категории: эритроцитам, тромбоцитам, лейкоцитам. Однако они менее надежны в качественных оценках. Например, анализатор может определить, что это гранулоцит, но он не будут столь же точным в определении стадии его созревания. Следующее поколение лабораторных приборов должно лучше оценивать этот показатель.
Сегодня все производители усовершенствовали технологию, связанную с принципом импеданса Коултера, и настроили свое программное обеспечение до такой степени, что могут извлечь максимально возможное число данных. В дальнейшем будут внедряться новые технологии, использующие функциональность клетки, а также синтез белка ее поверхности, который указывает на ее функции и стадию развития.
Граница с цитометрией
Некоторые анализаторы используют методы проточной цитометрии, в частности маркеры антигенов CD4 и CD8. Гематологические анализаторы Sysmex ближе всего подошли к этой технологии. В конечном итоге между ними не должно остаться никакой разницы, но для этого необходимо, чтобы кто-то увидел это преимущество.
Признаком возможной интеграции является то, что считавшиеся стандартными тесты, которые перешли к проточной цитометрии, возвращающейся в гематологию. Например, не будет удивительным, если анализаторы смогут выполнять подсчет эритроцитов плода, заменяя ручную технику теста КляйнхауэраБетке. Тест можно сделать методом проточной цитометрии, но его возвращение в лабораторию гематологии обеспечит ему более широкое признание. Вероятно, в конечном итоге этот ужасный с точки зрения точности анализ будет больше соответствовать тому, чего следует ожидать от диагностики в XXI веке.
Граница между гематологическими анализаторами и проточными цитометрами, вероятно, будет смещаться в обозримом будущем по мере развития технологий или методологий. Примером является подсчет ретикулоцитов. Сначала он производился вручную, затем на проточном цитометре, после чего он стал инструментом гематологии, когда методика была автоматизирована.
Перспективы интеграции
По мнению специалистов, некоторые простые цитометрические тесты можно адаптировать для гематологического анализатора. Очевидным примером является выявление регулярных подмножеств Т-клеток, прямого хронического или острого лейкоза, где все клетки однородны с очень ясным фенотипическим профилем. В анализаторах крови можно достаточно точно определять характеристики рассеяния. Случаи смешанных или действительно небольших популяций с необычными или более аберрантными фенотипическими профилями могут быть более сложными.
Однако некоторые высказывают сомнение, что гематологические анализаторы крови станут проточными цитометрами. Стандартный тест стоит намного дешевле и должен оставаться простым. Если в результате его проведения будет определено отклонение от нормы, то необходимо пройти другие анализы, но поликлиника или кабинет врача не должны этим заниматься. Если сложные тесты будут выполняться отдельно, они не будут увеличивать стоимость обычных. Специалисты высказывают сомнения в том, что обследование сложной острой лейкемии или большие панели, которые используются в проточной цитометрии, быстро вернутся в лабораторию гематологии.
Проточная цитометрия стоит дорого, но есть способы уменьшить затраты, по-разному комбинируя реагенты. Другим фактором, который тормозит интеграцию теста в гематологический анализатор, является потеря доходов. Люди не хотят терять этот бизнес, поскольку их прибыль уже сократилась.
Надежность и воспроизводимость результатов проточного анализа также важно учитывать. Методы, основанные на импедансе, являются рабочими лошадками в крупных лабораториях. Они должны быть надежными и быстрыми. И нужно убедиться, что они экономически выгодны. Их сила в точности и воспроизводимости результатов. А по мере того, как появляются новые приложения в области клеточной цитометрии, их нужно еще доказать и внедрить. Поточная технология требует хорошего контроля качества и стандартизации инструментов и реагентов. Без этого возможны ошибки. Кроме того, необходимо наличие подготовленного персонала, который знает, что он делает и с чем работает.
По мнению специалистов, появятся новые показатели, которые изменят лабораторную гематологию. Те инструменты, которые могут измерять флуоресценцию, находятся в гораздо лучшей ситуации, поскольку имеют более высокую степень чувствительности и избирательности.
ПО, правила и автоматизация
Пока визионеры смотрят в будущее, производители уже сегодня вынуждены бороться с конкурентами. В дополнение к подчеркиванию различий в технологии, компании выделяют свои продукты с помощью программного обеспечения, которое управляет данными и обеспечивает автоматическую проверку нормальных клеток на основе набора правил, установленных в лаборатории, что значительно ускоряет проверку и дает персоналу больше времени, чтобы сосредоточиться на аномальных случаях.
На уровне анализатора трудно отличить преимущества различных продуктов. В определенной степени наличие ПО, которое играет ключевую роль в получении результатов анализа, позволяет продукту выделиться на рынке. Прежде всего диагностические компании выходят на рынок программного обеспечения для защиты своего бизнеса, но затем они понимают, что системы управления информацией необходимы для их выживания.
С каждым поколением анализаторов ПО значительно улучшается. Новые вычислительные мощности обеспечивают гораздо лучшую избирательность при ручном расчете лейкоцитарной формулы. Возможность сокращения объема работ с микроскопом очень важна. Если есть точный инструмент, то достаточно только исследовать на гематологическом анализаторе патологические клетки, что повышает эффективность работы специалистов. И современные приборы позволяют добиться этого. Это именно то, что необходимо лаборатории: простота использования, эффективность и снижение объема исследований под микроскопом.
Вызывает обеспокоенность, что некоторые врачи клинико-лабораторной диагностики концентрируют свои усилия на совершенствовании технологий, а не на их оптимизации для принятия верных врачебных решений. Можно купить самый причудливый лабораторный инструмент в мире, но если при этом постоянно перепроверяются результаты, то это нивелирует возможности технологи. Аномалии не являются ошибками, и лаборатории, которые автоматически утверждают только результат гематологического анализатора Патологических клеток не обнаружено, поступают нелогично.
Каждая лаборатория должна определить критерии того, какие тесты должны пересматриваться, а какие подвергаться ручной обработке. Таким образом, общее количество неавтоматизированного труда сокращается. Появляется время для работы с анормальными лейкограммами.
Программное обеспечение позволяет лабораториям устанавливать правила автовалидации и выявления подозрительных проб на основе местоположения выборки или обследуемой группы. Например, если лаборатория обрабатывает большое количество образцов больных раком, систему можно настроить на автоматическое исследование крови на гематологическом анализаторе патологических клеток.
Важно не только автоматическое подтверждение нормальных результатов, но и сокращение числа ложноположительных результатов. Ручной анализ является наиболее технически сложным. Это самый трудоемкий процесс. Необходимо сократить время, которое лаборант проводит с микроскопом, ограничившись только анормальными случаями.
Производители оборудования предлагают высокопроизводительные системы автоматизации для крупных лабораторий, которые помогают справиться с нехваткой персонала. В этом случае лаборант помещает образцы в автоматическую линию. Затем система направляет пробирки в анализатор и далее затем для проведения дополнительных тестов или на склад с контролируемой температурой, откуда пробы можно оперативно взять для дополнительной проверки. Автоматизированные модули нанесения и окрашивания мазков тоже сокращают время работы персонала. Например, в гематологическом анализаторе Mindray CAL 8000 используется модуль обработки мазков SC-120, способный работать с образцами объемом 40 мкл при загрузке 180 предметных стекол. Все стекла нагреваются до и после окрашивания. Это оптимизирует качество и сокращает риск заражения персонала.
Степень автоматизации в лабораториях гематологии будет наращиваться, а количество персонала уменьшаться. Есть необходимость в сложных системах, в которые можно поместить образцы, переключиться на другую работу и вернуться только для пересмотра действительно аномальных образцов.
Большинство систем автоматизации настраивается под нужды каждой лаборатории, а в отдельных случаях доступны стандартизованные конфигурации. Некоторые лаборатории пользуются собственным ПО со своей информационной системой и алгоритмами отбора аномальных образцов. Но следует избегать автоматизации ради автоматизации. Крупные инвестиции в роботизированный проект современной дорогостоящей высокотехнологичной автоматической лаборатории оказываются напрасными из-за элементарной ошибки повторного проведения анализа крови каждой пробы с анормальным результатом.
Автоматизированный подсчет
Большинство автоматических гематологических анализаторов измеряют или подсчитывают следующие параметры: содержание гемоглобина, гематокритное число, количество и средний объем эритроцитов, средний гемоглобин, среднеклеточную концентрацию гемоглобина, количество и средний объем тромбоцитов и лейкоцитарную формулу.
Гемоглобин измеряется непосредственно из образца цельной крови с использованием метода, основанного на образовании цианометрагемоглобина.
При исследовании на гематологическом анализаторе подсчет эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов может быть произведен несколькими способами. Многие счетчики используют метод электрического импеданса. Он основан на изменении проводимости при прохождении клеток через небольшие отверстия. Размеры последних различаются для эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Изменение проводимости приводит к электрическому импульсу, который можно обнаружить и записать. Этот метод также позволяет измерить объем клетки. Определение лейкоцитарной формулы требует лизиса эритроцитов. Затем различные популяции лейкоцитов идентифицируются методом проточной цитометрии.
Гематологический анализатор Миндрей ВС-6800, например, после воздействия на образцы реагентами исследует их на основе данных о рассеянии света лазера и флуоресценции. Чтобы лучше идентифицировать и дифференцировать популяции клеток крови, особенно для выявления аномалий, не обнаруженных другими методами, строится 3D-диаграмма. Гематологический анализатор ВС-6800 помимо стандартных тестов позволяет получить данные о незрелых гранулоцитах (включая промиелоциты, миелоциты и метамиелоциты), популяциях флуоресцентных клеток (таких как бласты и атипичные лимфоциты), незрелых ретикулоцитах и инфицированных эритроцитах.
В гематологическом анализаторе МЕК-9100К компании Nihon Kohden форменные элементы крови перед прохождением через отверстие для высокоточного импедансного подсчета идеально выстраиваются с помощью потока с гидродинамической фокусировкой. Кроме того, данный метод полностью исключает риск повторного учета клеток, что значительно улучшает точность исследований.
Лазерная оптическая технология Celltac G DynaScatter позволяет получить лейкоцитарную формулу в почти естественном состоянии. В гематологическом анализаторе МЕК-9100К применяется 3-х угловой детектор рассеяния. Под одним углом можно определить количество лейкоцитов, под другим получить информацию о структуре клетки и сложности частиц нуклеохроматина, а с боку данные о внутренней гранулярности и глобулярности. Трехмерная графическая информация рассчитывается по эксклюзивному алгоритму Nihon Kohden.
Проточная цитометрия
Проводится для проб крови, любой биологической жидкости, диспергированного аспирата костного мозга, разрушенной ткани. Проточная цитометрия является методом, который позволяет характеризовать клетки по размеру, форме, ее биохимическому или антигенному составу.
Принцип данного исследования состоит в следующем. Клетки движутся по очереди через кювету, где они подвергаются воздействию пучка интенсивного света. Форменные элементы крови рассеивают свет во всех направлениях. Прямое рассеяние, возникающее в результате дифракции, коррелирует с объемом клетки. Боковое рассеяние (под прямым углом) является результатом преломления и приближенно характеризует ее внутреннюю гранулярность. Данные прямого и бокового рассеяния позволяют идентифицировать, например, популяции нейтрофилов и лимфоцитов, которые отличаются размером и зернистостью.
Для обнаружения различных популяций в проточной цитометрии также используется флуоресценция. Моноклональные антитела, используемые для идентификации цитоплазматических и клеточных поверхностных антигенов, чаще всего помечают флуоресцентными соединениями. Например, флуоресцеин или R-фикоэритрин имеют разные спектры излучения, позволяющие идентифицировать форменные элементы по цвету свечения. Клеточная суспензия инкубируется с двумя моноклональными антителами, каждое из которых маркируется разным флуорохромом. Поскольку форменные элементы крови со связанными антителами проходят через кювету, 488-нм излучение лазера возбуждает флуоресцентные соединения, вызывая их свечение на определенных длинах волн. Система линз и фильтров обнаруживает свет и преобразует его в электрический сигнал, который может быть проанализирован компьютером. Разные элементы крови характеризуются разным боковым и прямым рассеянием и интенсивностью испускаемого света на определенных длинах волн. Данные, составленные из тысяч событий, собираются, анализируются и сводятся в гистограмму. Поточная цитометрия используется при диагностике лейкемий и лимфом. Использование различных маркеров антител позволяет точно идентифицировать клетки.
В гематологическом анализаторе Sysmex для исследования гемоглобина используется лаурилсульфат натрия. Это нецианидный метод с очень коротким временем реакции. Гемоглобин определяется в отдельном канале, что минимизирует интерференцию от высоких концентраций лейкоцитов.
При выборе инструмента для исследования крови следует учитывать, сколько требуется реагентов для гематологического анализатора, а также затраты на них и требования безопасности. Можно ли их приобрести у любого поставщика или только у производителя? Например, Erba ELite 3 измеряет 20 параметров всего с тремя экологически чистыми и не содержащими цианид реагентами. В моделях Beckman Coulter DxH 800 и DxH 600 используются только 5 реагентов для всех случаев, включая подсчет ядросодержащих эритроцитов и ретикулоцитов. ABX Pentra 60 гематологический анализатор, в котором задействованы 4 реагента и 1 дилюент.
Также важен вопрос о частоте замены реагентов. Например, Siemens ADVIA 120 обладает запасом химических веществ для аналитических исследований и промывки, которого хватит для проведения 1850 тестов.
Оптимизация автоматизированного анализатора
По мнению специалистов, улучшению лабораторных инструментов уделяется слишком много внимания и недостаточно для оптимизации использования автоматизированных и ручных технологий. Частью проблемы является то, что сотрудники гематологических лабораторий обучаются анатомической патологии, а не лабораторной медицине.
Многие специалисты выполняют функции проверки, а не интерпретации. У лаборатории должно быть 2 функции: отвечать за результаты анализа и их интерпретировать. Следующим шагом будет практика доказательной медицины. Если после проведения 10 000 тестов не будет доказательств того, что они не могли быть автоматически верифицированы точно такими же результатами, то этим не следует заниматься. В то же время, если 10 000 анализов дали новую медицинскую информацию, то их следовало бы пересмотреть с учетом новых знаний. Пока доказательная практика находится на начальном уровне.
Обучение персонала
Другая проблема заключается в том, чтобы помочь лаборантам не только изучить инструкцию к гематологическому анализатору, но и понять получаемую с его помощью информацию. У большинства специалистов нет такого знания технологии. Кроме того, ограничено понимание графического представления данных. Необходимо подчеркивать его корреляцию с морфологическими выводами, чтобы можно было извлечь больше информации. Даже общий анализ крови становится слишком сложным, генерируя огромный объем данных. Вся эта информация должна быть интегрирована. Необходимо взвесить преимущества большего числа данных в сравнении с дополнительной сложностью, которую она привносит. Это не значит, что лаборатории не должны принимать высокотехнологичные достижения. Необходимо совмещать их с совершенствованием медицинской практики.
Источник:http://fb.ru/article/58581/gematologicheskiy-analizator—oblast-primeneniya-i-printsip-rabotyi